2018年第七届生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会报道

2018-06-10 22:09:16来源: 中国食品报网

  中国食品报四川讯(记者叶青) 2018年6月10日,“2018年第七届生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会暨中国生物发酵产业协会微生物育种分会第四次学术会议”进入第二天。

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  报告的专家及主讲的内容如下:

祁庆生

  祁庆生,山东大学教授。报告题目:基于非同源末端连接的微生物基因组编辑及应用。内容摘要:同源重组和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)是细胞内两种不同的DNA修复方式。在微生物中以同源重组为主,我们发现,外源NHEJ系统在修复CRISPR-cas9造成的DNA双链断裂时,可以造成DNA沿断裂点两个方向的DNA缺失可用于基因的删除。因此,我们以此建立了细菌的编辑,并拓展到T4DNA连接酶用于微生物随机突变的修复。

赵宗宝

  赵宗保,中国科学院大连化学物理研究所研究所研究员。报告题目:创制非天然辅酶依赖的生物体系。内容摘要:吡啶核苷酸辅酶NAD(P)及其还原态NAD(P)H是最重要的氧化还原辅酶,广泛参与胞内代谢过程,具有不可替代的重要作用。调控胞内吡啶核苷酸辅酶总量及其时空分布,对细胞生理代谢产生全局性但往往难以预测的影响。因此,建立基于非天然辅酶的体系,提升代谢调控的可预见性,具有重要科学意义和应用潜力。我们设计合成了多种非天然辅酶,如烟酰胺胞嘧啶二核苷酸 (NCD)等。本报告将介绍通过蛋白质工程策略改造苹果酸酶、亚磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、烟酸单核苷酸腺苷酰转移酶等的辅酶/底物结合口袋,获得偏好NCD的突变体,并成功应用于构建NCD介导的代谢子系统,实现途径选择性传递还原力,突破内源代谢网络的热力学瓶颈。还将简要介绍结构生物学研究突变酶与非天然辅酶相互作用的初步结果。上述研究对理性改造氧化还原酶、创制新型微生物细胞工厂具有重要参考价值。

蒋莹

  李春秀,华东理工大学副教授。报告题目:谷氨酰胺转氨酶生产菌株的诱变选育。内容摘要:谷氨酰胺转氨酶(EC 2.3.2.13,Transglutaminase,简称TGase或TG酶),是一种应用广泛的多功能酶,利用TG酶具有的交联特性可以显著改善蛋白质的结构及功能特性,因此TG酶在食品、生物医药等多种领域中都受到了广泛的关注与应用。目前,TG酶较为成熟的生产方式主要包括野生菌发酵和基因工程菌发酵,而应用于食品领域中的TG酶的主要来源为野生菌发酵,其中茂源链霉菌(Streptomyces mobaraense)是主要生产菌株。利用野生菌发酵生产TG酶时,TG酶产量受多种因素影响,其中性能优良菌株的获得是实现TG酶高产的关键之一。本研究以TG酶生产菌株Streptomyces mobaraense ECU7480为诱变出发菌株,利用新型高效的常压室温等离子体(ARTP)诱变育种技术对其进行多轮迭代诱变,在诱变过程中以90%诱变致死率为条件对突变库容量进行合理的控制,以每一轮诱变筛选得到的前八名突变株作为下一轮诱变的出发菌株进行迭代诱变。经八轮ARTP迭代诱变,最终得到四株正突变株Sm5-V1, Sm6-V13, Sm2-V10和Sm7-V12,其SmTGase发酵活力比出发菌株分别提高27.3%、24.4%、23.7%和19.6%,且经八次传代后突变株仍保持较高的产酶能力。将突变株SmTGase酶原基因的克隆鉴定发现,突变株SmTGase酶原的氨基酸序列与出发菌株相比并未发生改变,说明ARTP没有对目标蛋白基因序列产生直接的影响。利用荧光定量PCR检测目标基因的表达水平发现突变株SmTGase酶原基因的表达水平相较于出发菌株明显提高,说明ARTP虽然没有改变目标基因的编码序列,但可能改变了目标基因的表达水平,从而提高了突变菌株的SmTGase发酵活力。

何明雄

  何明雄,农业部沼气科学研究所研究员。报告题目:抗逆高效运动发酵单胞菌生物育种技术。内容摘要:我国目前尚有30%左右秸秆被弃置或焚烧,造成巨大资源浪费和环境污染。利用秸秆生产燃料乙醇及生物化学品对减轻农业环境污染和缓解能源危机等具有重要意义。但在秸秆生物转化过程中,预处理阶段产生的毒性物质及发酵终产物对微生物的抑制作用是制约其高效转化的限制因素和亟待解决难题之一。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)具有特殊ED代谢途径、较高乙醇发酵效率及代谢副产物少等优点,是较具潜力的纤维素乙醇转化系统。项目组围绕“抗逆高效纤维素生物质乙醇转化系统平台构建”,以运动发酵单胞菌为模式能源微生物,从胁迫应答分子机制、遗传平台优化与完善、代谢工程改造、生物质转化等进行了系统研究。一是从代谢和基因转录等方面揭示运动发酵单胞菌通过保持细胞膜完整性来应对纤维素水解物抑制物及乙醇等环境胁迫的分子机制,为抗逆高效生物质乙醇转化系统构建提供了科学依据。二是通过适应性进化、全局转录代谢调控工程(gTME)、转座突变、mARTP诱变及基因组重组等手段,获得了高效和抗逆等优点的生物质乙醇转化系统。三是形成了以抗逆高效运动发酵单胞菌为核心的秸秆资源燃料乙醇转化关键工艺技术。

赵心清

  赵心清,上海交通大学教授。报告题目:利用人工转录因子技术选育高效生物转化菌株。内容摘要:利用代谢工程改造微生物的挑战是很多性状受多基因控制,所以需要更高效的多基因改造方法。利用人工转录因子文库转化工业微生物,不仅可通过筛选获得性能提高的菌株,还可以通过对所获得的菌株进行进一步研究,发现更高效的代谢工程改造靶点。本课题组利用人工锌指蛋白文库获得了环境胁迫耐性提高的酵母菌株,同时也选育了纤维素酶活性提高的里氏木霉突变体。进一步研究所获得的菌株,发现了新的转录因子,分别对纤维素酶生产具有负调控和正调控。研究结果提示,人工转录因子技术可用于多种工业微生物的改造,提高生物转化效率。

唐双

  唐双焱,中国科学院微生物研究所研究员。报告题目:生物传感器辅助下的途径关键酶改造。内容摘要:在天然产物异源生物合成中,合成途径的过表达通常给宿主菌带来代谢负担,影响工程菌的生长进而造成产量下降。因此关键酶活性的提升是提高天然产物合成效率的重要手段。对香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)是合成一系列重要芳香族天然产物的途径关键酶。为了采用定向进化手段对该酶的活性进行改造,首先需要构建高通量筛选工具。我们改造了诱导调控蛋白TtgR,使其能够特异性结合白藜芦醇分子并激活其调控的启动子PttgR表达下游荧光蛋白。因此,通过监控细胞的荧光强度可实时反映细胞内白藜芦醇的浓度。这样的TtgR突变体可以作为白藜芦醇的生物传感器使用。在白藜芦醇的生物合成途径中,4CL是关键酶,通过建立4CL的突变体文库,并用白藜芦醇生物传感器高通量筛选白藜芦醇高产菌,成功获得了活性提高的4CL突变体,该高活力4CL不仅有助于白藜芦醇的高效合成,亦可用于一系列芳香族化合物的生物合成。

马遥宏

  马耀宏,山东省科学院生物研究所 研究员。报告题目:发酵过程在线检测技术进展。内容摘要:发酵过程的在线检测是以传感器为核心的信息发生与信息提取的关键技术,对发酵过程优化控制和智能化体系建设具有重要的作用。主要在线检测有物理传感器、化学传感器和生物传感器三种类型。目前,温度、压力、溶氧、pH值、搅拌器转速、通气量、流加物(底物、诱导物、前体)质量、料液体积、发酵液黏度、浊度等参数的在线检测已广泛应用,今后重点发展方向是生化(生物)参数的在线检测技术,其中生物传感器在线检测是具有快速、准确、成本低、操作简便等优势特点,是发酵过程在线检测与控制的重要工具。

X玉有

  郝玉有,中国科学院上海生命科学研究院研究员。报告题目:高通量筛选中的缩微化和自动化技术及应用。内容摘要:高通量筛选方法已经发展数十年,有些方法已经非常成熟,并在生物育种的“变、选、育”三个阶段中发挥了作用。高通量筛选方法的发展前提是微型化技术的研究和应用,以及培养、样品处理和分析检测等环节的通量匹配。缩微化作为微型化的一种,既在一定程度上满足高通量筛选的需要,又能兼顾到后续工艺条件放大的成功率,在培养环节,近年来缩微化新技术和新装置取得了长足进展。

  生物实验的全面自动化是另一个发展迅速的技术领域,即采用科研机器人(实验室机器人)技术代替实验人员完成重复性实验工作,在高通量筛选中的样品处理环节和分析测试环节已经有相应的自动化(科研机器人)技术可以应用。本文介绍了缩微化微型反应器和科研机器人技术及应用。

  赵海,中国科学院成都生物研究所。报告题目:高温酒曲微生物组分析和新资源发掘。内容摘要:中国白酒传统固态发酵技术延续使用了几千年,在这过程中,酒曲富集了大量对发酵十分关键的微生物群体。针对高温酒曲微生物群体和关键酶系的作用机理认识不清和微生物资源开发利用程度低等现状,本研究对高温浓香型和酱香型大曲微生物的作用机理和新资源的开发开展了深入挖掘工作,包括:通过微生物组学研究,深入解析高温酒曲的微生物多样性、优势微生物、功能微生物、功能酶系、代谢产物等在白酒发酵过程中的作用与机理,确立新的酒曲标准,富集高效酿造微生物群体,构建高效菌制剂和酶制剂,为改造和开发传统发酵工艺提供支持。

  现已利用现代高通量测序手段,实现了对浓香型和酱香型大曲的微生物多样性的生物信息分析,发现浓香型大曲细菌有341种,真菌有83种真菌;酱香型大曲细菌有791种,真菌有119种。与发酵相关的酵母群体主要可能是生丝毕赤酵母、毕赤酵母,酿酒酵母很少;与糖化相关微生物群体主要是嗜热子囊菌和嗜热霉,根霉、毛霉和曲霉较少。以上发现极大地拓展了对大曲微生物多样性的认识,颠覆了对酒曲功能微生物群体的传统认识。在此基础上,进一步开展了定向嗜热微生物的筛选,获得嗜热真菌属和耐热毕赤酵母属,证实了它们在高温大曲制作过程中的重要作用。

  同时,本研究克服了高温大曲RNA提取的不利因素,获取了浓香型和酱香型大曲的宏转录组信息,全面系统地解析了大曲丰富的酶资源。研究发现,浓香型大曲含有丰富酶系,糖苷健相关酶系大于996种,蛋白酶/脂肪酶/酯酶系大于518种;酱香型大曲高温阶段的糖苷键相关酶系大于182种;很多能量代谢、糖代谢、氨基酸代谢等途径,在制曲的升温阶段和高温阶段表达酶基因丰度最高。在宏转录组基础上,进一步开展了新颖耐热酶基因的挖掘,实现了大曲酶蛋白的异源表达,开创性实现了高温大曲酶蛋白资源的挖掘,获取了大量高温酒曲的特有耐热酶蛋白,以分析它们的酶学功能和潜在应用价值。

刘新利

  刘新利,齐鲁工业大学教授。报告题目:精酿啤酒产业优良菌株筛选。内容摘要:多种多样的精酿啤酒产品可以满足人们个性化的消费需求,产业发展潜力巨大。产品发酵过程中所用菌株受到原料成分、酒精度、酸度、氧含量、温度等重要因素的影响,本文首先以比利时精酿啤酒的传统工艺与文化入手,介绍了精酿啤酒产品的特点及对优良菌株的要求;然后介绍目前筛选、检测方法及发展趋势,为广大科研工作者提供一些基础信息。

王新荣

  王欣荣,四川抗菌素工业研究所研究员。报告题目:重要微生物药物的工艺研究实践与思考。内容摘要:微生物来源药物相比于化学合成药物,其来源特殊,结构类似组分多,结构复杂,而且需要经过菌种选育,发酵培养,提取精制等多个过程,研究技术难度大,开发周期长,投资数额大。因此如何筛选到产生菌,通过诱变和驯化培养其成为高产菌株,在发酵生产过程中实现高效表达,在许多结构类似的化合物中提取纯化目标产物,并且使其它杂质控制在允许限度内是微生物制药领域公认的技术瓶颈。

  快速高效地获得微生物药物的产生菌是开发微生物药物的首要问题。采用ARTP等物理诱变、化学诱变和推理选育相结合的高效育种体系,可以使产生菌实现高效育种。采用等离子体多种化学活性粒子对菌种细胞的基因损伤及SOS修复机制,组合低能氮离子束注入诱变与化学诱变技术,可大幅度提高菌种正突变率,通过MMC系统进行筛选,快速获得遗传稳定性良好的突变株。

  微生物工业发酵过程的代谢调控是一个复杂的多因素过程,直接影响发酵表达水平的高低及代谢产物的质量,是工业微生物发酵的核心问题之一。作者把微生物群作为一个生态系统进行平衡协调的研究,从培养基优化、培养条件和代谢调控等方面进行了各要素相互影响的研究。

  通过菌种选育与发酵工艺的研究,本课题组在一些重要微生物药物的生产工艺研究中取得了一些不错的结果。在阿卡波糖的发酵过程中,通过碳源和无机盐控制发酵液体系的渗透压和PH,使阿卡波糖的产量提高了550%; 在腺苷蛋氨酸的发酵过程中,通过添加生物素,流加葡萄糖控制细胞形态和PH,使发酵单位提高了320%;在他克莫司和多拉菌素的发酵过程中,通过调整C/N,影响发酵液PH、溶氧和发酵周期,使得发酵单位分别提高240%和52%;在FK520的发酵过程中,通过调整C/N,影响发酵液PH、溶氧和发酵周期,使得发酵单位分别提高367%,周期缩短25%,主要杂质FK523从7.5%降低到0.6%。

孙群

  孙群,四川大学教授、四川省微生物学会理事长。报告题目:高效真菌病害拮抗芽孢杆菌的选育。内容摘要:以一株从俄罗斯引进的抑菌效果优于商品生防芽孢菌的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)1841为出发菌株,经过ARTP诱变及γ射线辐射处理,从诱变菌株中筛选出3株正突变菌株M18、M73和M11。与出发菌株1841相比,诱变菌株的抑菌物质脂肽产量提高26%-35%,在相同浓度下其抑菌效果提高15%-21%。高分辨电喷雾质谱发现,诱变菌株产生了新的脂肽成分如Iturin a和SurfactinB,或者其Surfactin C和Iturin A、Iturin C的长碳链同系物比例增大;同时,诱变菌株扩散及生物膜形成能力增强。全基因组测序及重测序发现,诱变菌株在合成脂肽的非核糖体合成酶基因上存在多位点突变,从而提高脂肽非核糖体合成酶基因表达水平,甚至改变其表达产物结构。在实验室条件下,诱变菌株M73能很好地抑制链格孢菌造成的月季黑斑病,能延长番茄、龙眼和软枣猕猴桃的采后保鲜和货架期,表明诱变菌株具有很好的应用潜力。

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